原料乳中三聚氰胺快速检测方案GB/T22400－2008

HPLC-UV检测方法(GB/T22400－2008)

一、检测方法

1、 原理

用乙腈作为原料乳中的蛋白质沉淀剂和三聚氰胺提取剂，强阳离子交换色谱柱分离，高效液相色谱

-紫外检测器/二极管阵列检测器检测，外标法定量。

2、 试剂和材料

除另有说明外，所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T 6682规定的一级水。

2.1 乙腈（CH3CN）：色谱纯。

2.2 磷酸（H3PO4）。

2.3 磷酸二氢钾（KH2PO4）。

2.4 三聚氰胺标准物质（C3H6N6）：纯度大于或等于99%。

2.5 三聚氰胺标准贮备溶液：1.00×103 mg/L。

称取100 mg 三聚氰胺标准物质（准确至0.1 mg），用水完全溶解后，100 mL 容量瓶中定容至刻度，

混匀，4℃条件下避光保存，有效期为1 个月。

2.6 标准工作溶液：使用时配制。

2.6.1 标准溶液A：2.00 ×102 mg/L。

准确移取20.0 mL 三聚氰胺标准贮备溶液（4.5），置于100 mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。

2.6.2 标准溶液B：0.50 mg/L。

准确移取0.25 mL 标准溶液A（4.6.1），置于100 mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。

2.6.3 按表1 分别移取不同体积的标准溶液A（4.6.1）于容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。按表2

分别移取不同体积的标准溶液B（4.6.2）于容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。

2.7 磷酸盐缓冲液：0.05 mol/L。

称取6.8 g磷酸二氢钾（4.3）（ 准确至0.01 g），加水800 mL完全溶解后，用磷酸（4.2）调节pH至3.0，

用水稀释至1 L，用滤膜（4.9）过滤后备用。

2.8 一次性注射器：2 mL。

2.9 滤膜：水相，0.45 μm。

2.10 针式过滤器：有机相，0.45 μm。

2.11 具塞刻度试管：50 mL。

3 仪器

3.1 液相色谱仪：配有紫外检测器/二极管阵列检测器。

3.2 分析天平：感量0.0001 g 和0.01 g。

3.3 pH 计：测量精度±0.02。

3.4 溶剂过滤器。

4 测定步骤

4.1 试样的制备

称取混合均匀的15 g原料乳样品（准确至0.01 g），置于50 mL具塞刻度试管（4.11）中，加入30 mL

乙腈（4.1），剧烈振荡6 min，加水定容至满刻度，充分混匀后静置3 min，用一次性注射器（4.8）吸

取上清液用针式过滤器（4.10）过滤后，作为高效液相色谱分析用试样。

4.2 高效液相色谱测定

4.2.1 色谱条件

a) 色谱柱：强阳离子交换色谱柱，SCX，250 mm × 4.6 mm（i.d.），5 μm，或性能相当者。

注： 宜在色谱柱前加保护柱（或预柱），以延长色谱柱使用寿命。

b) 流动相：磷酸盐缓冲溶液（4.7）- 乙腈（70+30，体积比），混匀。

c) 流速：1.5 mL/min。

d) 柱温：室温。

e) 检测波长：240 nm。

f) 进样量：20 μL。

4.2.2 液相色谱分析测定

4.2.2.1 仪器的准备

开机，用流动相平衡色谱柱，待基线稳定后开始进样。

4.2.2.2 定性分析

标准溶液A体积（mL） 0.10 0.25 1.00 1.25 5.00 12.5

定容体积（mL） 100 100 100 50.0 50.0 50.0

标准工作溶液浓度（mg/L） 0.20 0.50 2.00 5.00 20.0 50.0

标准溶液B体积（mL） 1.00 2.00 4.00 20.0 40.0

定容体积（mL） 100 100 100 100 100

标准工作溶液浓度（mg/L） 0.005 0.01 0.02 0.10 0.20

依据保留时间一致性进行定性识别的方法。根据三聚氰胺标准物质的保留时间，确定样品中三聚氰

胺的色谱峰（参见附录A）。必要时应采用其他方法进一步定性确证。

4.2.2.3 定量分析

校准方法为外标法。

4.2.2.3.1 校准曲线制作

根据检测需要，使用标准工作溶液（4.6.3）分别进样，以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为

纵坐标，绘制校准曲线。

4.2.2.3.2 试样测定

使用试样（6.1）分别进样，获得目标峰面积。根据校准曲线计算被测试样中三聚氰胺的含量（mg/kg）。

试样中待测三聚氰胺的响应值均应在方法线性范围内。

注：当试样中三聚氰胺的响应值超出方法的线性范围的上限时，可减少称样量再进行提取与测定。

4.2.3 结果计算

4.2.3.1 计算公式

结果按式（1）计算：

式中：

X——原料乳中三聚氰胺的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；

c ——从校准曲线得到的三聚氰胺溶液的浓度，单位为毫克每升（mg/L）；

V——试样定容体积，单位为毫升（mL）；

m——样品称量质量，单位为克（g）。

4.2.3.2 计算结果有效数字

通常情况下计算结果保留3位有效数字；结果在0.1~1.0 mg/kg时，保留2位有效数字；结果小于0.1

mg/kg时，保留1位有效数字。

4.3 平行试验

按以上步骤，对同一样品进行平行试验测定。

4.4 空白试验

除不称取样品外，均按上述步骤同时完成空白试验。

4.5 方法检测限

本方法的检测限为0.05 mg/kg。

4.6 回收率

在添加浓度0.30 mg/kg~100.0 mg/kg范围内，回收率在93.0%~103%之间，相对标准偏差小于10%。

5 精密度

本标准精密度数据按照GB/T 6379.1和GB/T 6379.2规定确定，其重复性和再现性值以95%的置信度

计算。

5.1 重复性

在重复性条件下，获得的两次独立测量结果的绝对差值不超过重复性限r，样品中三聚氰胺含量范

围及重复性方程见表3。

如果两次测定值的差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。

5.2 再现性

在再现性的条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，样品中三聚氰胺的含

量范围及再现性方程见表3。

7.3 重复性与再现性参考值

表4列出了m在不同范围时的r与R值，供参考。

8 试验报告

试验报告应包括以下内容：

a) 鉴别样品、实验室和分析日期等资料；

b) 遵守本标准规定的程度；

c) 分析结果及其表示；

d) 测定中观察到的异常现象；

e) 对分析结果可能有影响而本部分未包括的操作或者任选的操作。

9 质量保证

a) 操作人员应按照国家相关规定，并具备从事相应实验技术的能力；

b) 仪器及相关计量器具应通过检定或校准，并在有效使用期内；

c) 宜采用有证标准物质，若采用自配标样，应使用有证标准物质对自配标样进行验证；

d) 原料乳样采集和保存应严格执行本标准和国家相关规定，实施全过程质量保证。

10 注意事项

a) 如果保留时间或柱压发生明显的变化，应检测离子交换色谱柱的柱效以保证检测结果的可靠

性；

b) 使用不同的离子交换色谱柱，其保留时间有较大的差异，应对色谱条件进行优化；

c) 强阳离子交换色谱的流动相为酸性体系，每天结束实验时应以中性流动相冲洗仪器系统进行维

护保养。

五、高效液相色谱仪三聚氰胺快速检测配置报价

1）                 STI 5000型液相色谱仪系统

1	P5000 型高压恒流输液泵	1台
2	UV5000紫外检测器	1台
3	Rheohyne 7725i 手动进样阀	1支
4	三聚氰胺分析专用液相色谱柱	1支
5	25/50ul微量注射器	1支
6	N2000色谱工作站（SP1版）	1套
7	液相启动工具包	1套
	合计金额：

2)                           液相附助设备

1	KQ-2200　超声波清洗器 3L	1台
2	HP-01袖珍式真空泵 0.80MP	1台
3	FB-10T溶剂过滤器  1000mL	1台
4	有机过滤膜  φ50×0.45mm	1盒
5	水系过滤膜  φ50×0.45mm	1盒
6	有机针式过滤器  φ13×0.45mm	1盒
7	水系针式过滤器  φ13×0.45mm	1盒
	合计金额：

 VERTEX系列液相色谱仪主要指标

一、P5000高压恒流输液泵

技术指标	产品说明
等度泵 流速精度：0.1% 流速范围：0.001～10ml/min/0.001ml增量 最高耐压：6000psi（0～10ml/min） 压力脉冲：<1%	特点说明   双柱塞串联式往复泵,自动脉冲抑制系统 输液泵开机自检，自动判断故障 泵头各部件单独设计，便于拆装维护 内置高低压报警和保护功能 多种泵头选择：微量泵、分析泵、半制备/制备泵 自动检测泵头类型，智能修正参数设置 程序化溶剂压缩因子，能自动补偿流量 梯度由内部软件实现自动控制，可编辑、存贮60个梯度方法，能运行复杂的梯度程序    可以通过外部接点闭合控制。 独特优点：    独特的柱塞杆自动清洗装置，使P5000系列高压输液泵不需要花钱购买在线清洗装置，也无须担心盐类晶体的析出对柱塞杆造成损伤；    专利设计的“浮动式泵柱塞杆密封圈”技术，可设定溶剂相应的压缩因子，泵头可以自动排空，无须手动排空即可输液；可延长密封圈使用寿命；    P5000型输液泵使用的“自吸式单向阀”，是世界上最好的单向阀，阀球能在溶剂通过单向阀后回流之前回到阀座将之密封，保障了泵流量超常的稳定。    优秀的单向阀设计与先进的“浮动式泵柱塞杆密封圈”技术，使P5000输液泵在0-10ml/min的流量范围内都能耐压6000Psi，且压力波动远小于10Psi，成为国内外压力波动最小的泵之一。 拥有用户至关重要的两大功能     ①自动排空  ②自动清洗
二元梯度泵 流速精度：0.1% 流速范围：0.001～10ml/min（等度）， 0.001～10ml/min（梯度）/0.001ml增量 延迟体积：<150uL 最高耐压：6000psi（0-10ml/min） 压力脉冲：<1% 比例精度：±0.2%, 2ml/min
四元梯度泵 流速精度：0.1% 流速范围：0.001～10ml/min，0.001ml增量 延迟体积：<400uL 最高耐压：6000psi（具高低压保护功能） 压力脉冲：<1% 外置4流路在线真空脱气机
制备泵 流速精度：0.1% 流速范围：0.2～80ml/min（等度）， 0.2～100ml/min（梯度），0.001ml增量 延迟体积：<150uL 压力脉冲：<1.5% 比例精度：±0.2%,5ml/min

自吸式单向阀-世界上最为优秀的单向阀

高压输液泵所使用的ASI自吸式单向阀是目前世界上最好的单向阀，它产生的流量有非常好的可重复性与准确性，这意味着单向阀能保持非常好的重复性。下图是Waters公司的单向阀与ASI公司的单向阀的使用比较，显而易见，ASI的自吸式单向阀的性能效果要优于Waters的单向阀。（Data Certifiedby:Baseline Services, Mercerville, NJ May 21, 1997,BodmanChromatography Aston, PA May 21, 1997）

十、VERTEX系列液相色谱仪主要指标

二、UV5000紫外可见检测器

技术指标	产品说明
UV5000紫外可见检测器 光源：氘灯、钨灯 灯寿命：氘灯（质保寿命2000Hrs） 氘灯更换简单，快捷，自动校准。 波长：190～700nm（步增1nm）， 可由键盘或RS-232设定 波长准确度：≤±1nm 波长精度：≤±0.1nm 波长带宽：＜6.0nm（250nm，半高处） 线性度：优于104 噪声：＜±7.5×10-6AU（动态） 飘移：＜ 3.0×10 -4AU/H（动态） 最小检测浓度：1.0×10 -8 AU（萘的甲醇溶液） 样品池：标准（5mm光程，10uL体积）， 可选微量池，半制备池，制备池。 输入/输出：进样信号控制（事件），自动调零。 16个量程可供选择（0.0005-10.0AU） 尺寸/重量：16cm×25cm×35cm/6.0kg 电源：85～240V、47～63Hz、60W	特点说明 开机自检，仪器内部安全报警与自动故障排查功能，维护方面快捷。 波长自动校正，波长准确度和稳定性高； 德国原装进口氘灯和氘灯电源，稳定且寿命长；实时显示样品和参比能量显示； 更换氘灯时，不必调整光轴，维护简便；可手动关/开氘灯，延长灯的使用寿命； RS-232数字通讯，软件与仪器的联控，直接鼠标点击，就可以完成各种检测； 高亮度OLED显示屏，美观稳定； 多量程输出选择满足各浓度分析需求； 独特优点：    仪器内部安全报警与自动故障排查功能；    人性化、便携化的软件界面，操作便捷、快速，可根据用户要求进行定制； 光路系统采用精密定位结构和独特的散热技术，具有精度高，偏移小和稳定时间短       独特的池结构，高效的光学系统和数字过滤极大的提高了仪器的灵敏度和结果的准确性和重复性，并使仪器仪表具有优越的噪音水平和基线稳定性。
N2000色谱数据工作站（SP1版）
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另有：示差折光检测器、荧光检测器、蒸发光散射检测器、自动进样器等可选

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